Yazar "Zainalbden, Hasanain Akram Zainalbden" seçeneğine göre listele
Listeleniyor 1 - 1 / 1
Sayfa Başına Sonuç
Sıralama seçenekleri
Öğe In vitro correction of hbb v6g mutation in lymphocyte cells of patients with sickle cell anemia using genome-editing crispr / cas9 technique(Selçuk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2018) Zainalbden, Hasanain Akram Zainalbden; Koçak, NadirOrak hücre hastalığı OHA kırmızı kan hücrelerinde oksijen taşıyan bir protein olan hemoglobinin anormal oluşumu ile karakterize bir kalıtsal kan hastalığıdır. Orak hücreli anemi akciğerden vücuttaki hücrelere oksije taşıyan hemoglobinin mutant formu tarafından meydana getirilmektedir. Hemoglobin farklı genler tarafından kodlanan a-globin ve b-globin olamak üzere iki polipeptiden oluşmuştur. Herbir fonksiyonel hemoglobin molekülü iki a-globin ve iki b-globini içerir. Orak hücreli anemide b-globini kodlayan gendeki bir mutasyon proteindeki 146 aminoasitten birinde bir aminoasit yer değişikliğine yolaçmaktadır. Bakıldığında orak hücreli anemide ki mutasyon bir DNA nükleotinde değişikliği olup mRNA'da kodon 6 daki GAG dizisini GUG şeklinde dönüştürmekte, buda b-globinde glutamik asit yerine valin gelmesinde yolaçmaktadır. Proteindeki diğer aminoasitler bu mutasyondan etkilenmemektedir. Bu ciddi hastalık dünya çapında milyonlarca çocuğu etkilemektedir. Genom düzenleme tekniklerindeki son gelişmeler programlanabilir nükleazlar kullanılarak istenen herhangi bir DNA dizisini değiştirmek mümkün hale getirmiştir. Bu yeni nesil genom değiştirici araçlar özellikle orak hücre hastalık OHA gibi hastalıkların tedavesine yönelik terapötik uygulamalar için ideal adaylardır. OHA için destekleyici tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde önemli bir başarı elde edilmiştir, ama ne yazık ki hala uzun vadeli evrensel tedavi eksikliği vardır. Günümüzde mevcut küratif tedavi sağlıklı vericilerden allojenik kök hücre transplantasyonu dayanmaktadır; Bununla birlikte, bu tedavi, sadece sınırlı sayıda hastalara uygulanabilmektedir. Genome editing teknolojilerinde son birkaç yıl içerisinde önemli gelişmeler sağlandı. Günümüzde yaygın olarak kullanılan genom editing teknoljileri ZFN (Zinc Finger Nucleases), TALEN (Transc ription Activator-Like Effector Nucleases) ve CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) teknolojileridir. ZFN and TALEN genomik bölgeyi hedfelemek için DNA binding domaine eklenen endonükleazlardan oluşturulurken, CRISPR`da bu guide RNA ve Cas9 aracığıyla gerçekleşmektedir. Bu endonükleazlar aracılığıyla oluşturulan çift DNA zincir kırıkları homolog direkt tamir veya homolog olmayan uç birleştirmeleri yoluyla tamir edilmekte ve buda insersiyon veya delesyonlarla sonuçlanmaktadır. Bu teknolojiler hedef genom bölgelerinin düzeltilmesinde hücrenin normal DNA tamir mekanizmlarını kullanmakta ve değişik genetik hastalıklarda genomun manupülasyonu amacıyla uygulanmaktadır. Bu genom editing araçları ayrıca gen fonksiyon analizi, yeni tedavi hedeflerinin bulunması ve yeni yolakların araştırılmasında kullanılabilmektedir. Projemizde CRISPR/Cas9 tekniği kullanılarak sickle cell anemia neden olan V6 G mutasyonunu yok etmeyi amaçlandı. Projemizde V6G mutasyonunu içeren orak hücrel anemili vakalardan elde edilen lenfosit hücreleri kullandık. Bunun için öncelikle hedeflediğimiz bölgeye özgü rehber RNA'yı dizayn ettik. Bu rehber RNA sekansını (gRNA) vektöre aktardıktan sonra vektörü E. coli bakteri hücresinde çoğaltik. Bakteri kültüründen plazmid izolasyonundan sonra, vektörü Polyethylenimine (PEI) transfeksiyon yoluyla lenfosit hücrelerine transfekte ettik. Hücre kültürü, sterile koşullarda bir veya iki hafta daha devam edildi. Ardından DNA izolasyonunu takiben Knockout'u doğrulamak için real-time PCR analizi yapıldı.