Canine parvovirus ve canine coronavirus etkenlerin eş zamanlı teşhisine yönelik kit geliştirilmesi

Köpek Parvovirusu (CPV) ve Köpek Coronavirusu (CCoV), evcil ve yabani köpeklerde sıklıkla görülen enfeksiyöz hastalıklardandır. Bu iki virus, çoğu vakada birlikte de teşhis edilebilmektedir. Bu virusların teşhisinde IFAT, PCR, RT-PCR veya ELISA gibi teknikler kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, CPV ve CCoV etkenlerini eş zamanlı teşhis edebilecek, immunfloresans temelli ve 96 gözlü mikropleytte uygulanacak bir teşhis metodu geliştirmektir. Çalışmada kullanılmak üzere 380 adet köpek dışkı numunesi toplandı. Nükleik asit ekstraksiyonları yapılan örnekler RT-PCR tekniği ile hem CPV hem de CCoV yönünden test edildi ve pozitiflik durumlarına göre sınıflandırıldı. Bu veri, geliştirilen test tekniğinin (MIFADA) validasyonu, sensitivite ve spesifitesinin hesaplanmasında kullanıldı. Solid faz olarak 96 gözlü mikropleyt kullanıldı. Her gözün sol tarafına karbonat bikarbonat tamponu içerisinde 1µl Anti-CPV (H69D), sağ tarafına ise 1 µl Anti-CCoV (M87073) primer monoklonal antikoru damlatıldı ve 16 saat inkübe edildikten sonra bloklama işlemi yapılarak pleyt hazır hale getirildi. Antikor seçimleri bir dizi ayrıntılı in-silico analizden elde edilen verilere göre yapıldı. Kontrol örneklerinin eklenmesi ve inkübasyonunu takip eden süreçte CPV ve CCoV için FITC etiketli konjugat kullanılarak kaplama bölgeleri demonstre edildi ve floresans mikroskobunda fotograflandı. Test optimizasyon çalışmalarında doğruluğu artırmak ve hassas ölçüm yapabilmek için GPU destekli yazılımsal görüntü iyileştirmeleri yapılacak ve testte kullanılması gereken yakalayıcı antikor ve konjugat titreleri hesaplandı. Optimize edilen teknik, RT-PCR ile teşhis edilen örnekler ile uygulandı ve sonuçlar karşılaştırıldı. Bu karşılaştırmaya göre testin sensitivitesinin RT-PCR'a kıyasla %94, spesifitesinin ise %100 olduğu görüldü. Bu bilgiler ışığında geliştirilen test kitinin, gelecek çalışmalarla test üretim tekniğinin iyileştirilmesi ve farklı antijenleri/antikorları teşhis edebilme yeteneğinin araştırılması ile hızlı, kolay uygulanan, ekonomik, güvenilir ve yüksek doğrulukla sonuç verebilen bir test kiti olarak kullanılmaya aday olduğu ortaya konuldu.

Canine Parvovirus (CPV) and Canine Coronaviruses (CCoV) are infectious diseases frequently observed in domestic and wild dogs. These viruses can often be diagnosed together in most cases. The techniques such as IFAT, PCR, RT-PCR, or ELISA are employed for the diagnosis of these viruses. The aim of this study is to develop a diagnostic method based on immunofluorescence, applicable to a 96-well microplate, capable of simultaneously diagnosing CPV and CCoV pathogens. A total of 380 canine fecal samples were collected for use in the study. The extracted nucleic acids from these samples were tested for both CPV and CCoV using the RT-PCR technique, and the results were categorized based on positivity. This data was utilized for the validation of the developed test technique (MIFADA) and for calculating sensitivity and specificity. A 96-well microplate was used as the solid phase. On the left side of each well, 1 µl of Anti-CPV (H69D) in carbonate-bicarbonate buffer was added, and on the right side, 1 µl of Anti-CCoV (M87073) primary monoclonal antibody was dropped. After a 16-hour incubation, the plate was blocked to make it ready for use. The antibody selections were based on detailed in-silico analyses. Control samples were added, and following incubation, coating areas for CPV and CCoV were demonstrated using FITC-labeled conjugate and photographed under a fluorescence microscope. In the optimization process, GPU-supported software image enhancements were implemented to increase accuracy and enable precise measurements. The capture antibodies and conjugate titers required for the test were calculated. The optimized technique was applied to samples which diagnosed by RT-PCR, and the results were compared. According to this comparison, the test demonstrated a sensitivity of 94% compared to RT-PCR and a specificity of 100%. As a result of this information, it was revealed that the developed test kit has the potential to be used as a rapid, easily applicable, economical, reliable, and highly accurate diagnostic method. Further research is recommended to improve the test production technique and explore the ability to diagnose different antigens/antibodies in future studies.