Fare embriyolarının tipIII antifreeze protein ve human heat shock protein 70 ile vitrifikasyonu ve çözdürülmesi sonrası in vitro gelişim oranlarına etkisi

Sunulan tez çalışmasında fare embriyolarının vitrifikasyon medyumlarına eklenen Antifreeze Protein tip III (AFPIII) ve Human Heat Shock Protein 70'in dondurma çözdürme sonrası in vitro gelişim ve hücre sayıları üzerine etkisi incelendi. Toplamda 10 adet dişi fareye senkronizayon amaçlı 10 IU PMSG enjeksiyonundan 48 saat sonra 10 IU hCG intraperitoneal olarak enjekte edildi. Fareler hCG enjeksiyonundan hemen sonra aynı kafeste 2 dişi 1 erkek olacak şekilde çiftleştirildi. Çiftleştirmeden 24 saat sonra farelerde vaginal plug oluşumu kontrol edildi ve vaginal plug bulunan fareler operasyon masasına alındı. Farelerin ötenazileri yapıldıktan sonra pronüklear aşamadaki embriyolar CO2 gerektirmeyen 150 IU hyaluronidaz içeren Human Tubal Fluid - 4-(2-hidroksietil)-1-piperazine etansulfonik asit (HTF-HEPES) medyumu içerisine aktarılarak kümülüsleri uzaklaştırıldı. Embriyolar donduruluncaya kadar ekilibrasyon medyumu içerisinde 37oC'de inkübatörde bekletildi. Pozitif control (K+), negatif control (K-), Antifreeze Protein tip III (AFPIII)'ün 200, 400 ve 800 ng/ml (AFPIII200, AFPIII400, AFPIII800) ve Human Heat Shock Protein 70 (HHSP70)'in 1, 2 ve 4µg/ml (HHSP70-1, HHSP70-2, HHSP70-4) dozları kullanılarak toplamda 8 grup oluşturuldu ve katı yüzey vitrifikasyon (solid surface vitrification, SSV) solüsyonu hazırlandı. Embriyolar bu medyumlarda vitrifikasyon yöntemi ile donduruldu. Dondurulan embriyolar, gelişim oranlarının belirlenmesi amacıyla çözdürülerek kültür medyumuna aktarıldı ve in vitro gelişim oranları 24, 48, 72 ve 96. saatlerde izlendi. Tam blastosist aşamasına gelen embriyolardan her gruptan 4'er tane alınarak iç hücre kitlesi (ICM), trofektoderm (TE) ve toplam hücre sayılarının belirlenmesi amacı ile Hoeschst 33258 ve propidium iyot (PI) boyaları ile boyandı. Elde edilen in vitro gelişim oranları, ICM, TE ve toplam hücre sayılarının istatistiksel analizleri SPSS 25.0 programı One – Way ANOVA ile yapıldı. Embriyoların in vitro gelişimleri açısından 0 ve 24. saatlerde elde edilen oranlar açısından gruplar arasında istatistiksel bir farklılık tespit edilemezken (p>0,05); 48, 72 ve 96. saatlerde elde edilen oranlar açısından gruplar arasında istaistiksel farklılıkların olduğu belirlendi (p<0,05). İn vitro gelişim açısından 48. saatte K+ ve AFPIII400 grupları ile AFPIII200 ve HHSP70-4 grupları; 72. saatte K+ grubu ile K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları, AFPIII400 grubu ile HHSP70-4 grubu; 96. saatte K+ grubu ile K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları, AFPIII400 grubu ile HHSP70-1 ve HHSP70-4 grupları arasında elde edilen oranlar arasındaki farklılıklar önemli (p<0,05) bulundu. ICM sayıları açısından K+ grubu ve AFPIII400 grupları ile K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları, TE açısından K+ ve AFPIII400 grubu ile K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları, AFPIII200 grubu ile K-, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları, Toplam hücre sayıları açısından K+ ve AFPIII400 grubu ile K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları, AFPIII200 grubu ile K, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 ve HHSP70-4 grupları arasında elde edilen oranlar arasındaki farklılıklar istatistiksel açıdan önemli (p<0,05) bulundu. Sonuç olarak pronüklear embriyoların dondurulmasında Antifreeze protein tip III'ün 400 ng/ml kullanımının oldukça etkili olduğu tespit edildi.

In the thesis study presented, the effects of Antifreeze Protein type III (AFPIII) and Human Heat Shock Protein 70 added to vitrification medium of mouse embryos on in vitro growth and cell numbers after freezing and thawing were investigated. A total of 10 female mice were injected intraperitoneally with 10 IU hCG 48 hours after 10 IU PMSG injection for synchronization. Mice, after hCG injection, 2 females and 1 male were mated in same cage. 24 hours after mating, the condition of the vaginal plug in mice was checked and the mice with vaginal plugs were taken to the operating table. After the mice were euthanized, their cumulus was removed by transferring the embryos at the pronuclear stage into Human Tubal Fluid - 4-(2-hidroxyethyl)-1- piperazine ethanesulfonic acid (HTF-HEPES) not requiring CO2 and containing 150 IU hyaluronidase. The embryos were kept in equilibration medium at 37oC until they were frozen. Positive control (K+), negative control (K-), containing doses of Antifreeze protein type III (AFPIII) 200, 400 and 800 ng/ml (AFPIII200, AFPIII400, AFPIII800) and Human Heat Shock Protein 70 (HHSP70) 1, 2 and 4 µg/ml (HHSP70-1, HHSP70-2, HHSP70-4) a total of 8 groups was formed and solid surface vitrification (SSV) medium was prepared. Following the embryos were vitrified in these medium, they were thawed and transferred to the culture medium and in vitro development rates were followed at 24, 48, 72 and 96 hours. Four embryos at the full blastocyst stage were taken from each group and stained with Hoeschst 33258 and propidium iodine (PI) dyes in order to determine the inner cell mass (ICM), trophectoderm (TE) and total cell numbers. Statistical analyzes of obtained in vitro growth rates, ICM, TE and total cell numbers were performed with SPSS 25.0 program One-Way ANOVA. While there was no statistical difference among the groups in terms of in vitro development of embryos at the 0 and 24th hours (p> 0,05), It was determined that there were significiant statistical differences between the groups in the rates obtained at 48, 72 and 96 hours (p<0,05). For in vitro fertilization, at the 48th hours between K+ and AFPIII400 groups and AFPIII200 and HHSP70-4 groups; At the 72nd hours between K+ group and K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups, between AFPIII400 group and HHSP70-4 group; at the 96th hours between K+ group and K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups, between AFPIII400 group and HHSP70-1 and HHSP70-4 groups (p <0,05). In terms of ICM numbers between K+ and AFPIII400 groups and K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups; in terms of TE numbers between K+ and AFPIII400 and K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups, between AFPIII200 group and K-, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups; in terms of total cell number between K+ and AFPIII400 and K-, AFPIII200, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups, between AFPIII200 group and K, AFPIII800, HHSP70-1, HHSP70-2 and HHSP70-4 groups were found to be statistically significant (p <0.05).