Farklı katkı maddeleri ile dondurulan boğa spermasının değerlendirilmesi

Bu çalışmada boğa spermasının dondurulmasında Tris bazlı sulandırıcıya melatonin ve lipozom ilavesinin çözüm sonu spermatolojik parametreler üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu amaçla normospermi gösteren üç baş boğadan suni vajen yoluyla elde edilen ejakülatlar birleştirilerek deney grupları oluşturuldu. Oluşturulan Gliserol %5 (G5) ve Gliserol %3+60 mM Trehaloz (G3T) içeren tris bazlı sulandırıcılara farklı dozlarda melatonin ve lipozom ilaveleri yapıldı. Birleştirilen ejekülatlar 10 eşit hacme bölünerek G5, G5+ 0.25 mM melatonin (G5M0.25), G5+ 0.75 mM melatonin (G5M0.75), G5+ 1,25 µl/ml lipozom (G5L1.25), G5+3,75 µl/ml lipozom (G5L3.75), G3T, G3T+0,25 mM melatonin (G3TM0.25), G3T+0,75 mM melatonin (G3TM0.75), G3T+1,25 µl/ml lipozom (G3TL1.25), G3T+3,75 µl/ml lipozom (G3TL3.75) sulandırıcılarıyla sulandırıldı. Sulandırma işlemi 37o C ta yapıldı ve sulandırılan sperma numuneleri ekilibrasyon ve payetleme işleminin ardından sıvı azot buharında dondurularak sıvı azotta saklandı. Dondurma çözdürme sonrası sperma numunelerinde motilite, flow sitometri analizinde ölü-canlı oranı (SYBR+), plazma membran ve akrozom bütünlüğü (MPAI), mitokondriyal oksidatif stres (MITOSOX+) ve spermatozoon apoptozis oranı (Annexin V) parametreleri değerlendirildi. Çözüm sonu spermatozoon motilite oranları G5, G5M0.25, G5M0.75, G5L1.25, G5L3.75, G3T, G3TM0.25, G3TM0.75, G3TL1.25, G3TL3.75 gruplarında sırasıyla; %61,7±0,01; %69,20±0,02; %60,80±0,01; %65,80±0,02; %60,00±0,01; %63,30±0,01; %66,70±0,02; %60,80±0,01; %67,50±0,02; %59,20±0,01 olarak saptandı. Motilite değerleri karşılaştırıldığında G5M0.25 grubunda en yüksek çözüm sonu motilite değeri (%69,20±0,02) elde edildi (p<0.001). G5M0.25 grubu; G5 (%61,7±0,01), G5M0.75 (%60,80±0,01), G5L3.75 (%60,00±0,01), G3T (%63,30±0,01), G3TM0.75 (%60,80±0,01), G3TL3.75 (%59,20±0,01) gruplarına göre çözüm sonu motilite açısından daha yüksek oranda iyileşme sağladı (p<0,001). G3TM0.25 ve G3TL1.25 grupları G5 grubuna göre çözüm sonu motilite değerini önemli oranda iyileştirdi (p<0,001). Flow sitometri analiz sonuçlarında ölü-canlı oranı, plazma membran ve akrozom bütünlüğü, mitokondrial oksidatif stres seviyesi ve apoptoz oranları açısından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi (p>0,05). Boğa spermasının dondurulmasında Tris bazlı sulandırıcıya ilave edilen melatonin'in çözüm sonu spermatolojik parametreleri iyileştirdiği kanaatine varıldı. Melatonin'in 0,25 mM ve 0,75 mM dozlarında G3T ve G5 ortamına ilavesiyle her iki sulandırıcıda benzer sonuçlar verdiği saptandı. Sonuç olarak düşük oranda gliserol içeren G3T sulandırıcısına antioksidan ilavesiyle G5 sulandırıcısı kadar çözüm sonu spermatolojik parametreleri koruduğu ve iyileştirdiği; G5 sulandırıcısının yerine kullanılabileceği görüldü (p<0,001). Gliserolün fertilite üzerindeki toksik etkisinin ve özellikle düşük gliserol kullanımından doğabilecek spermatolojik parametrelerdeki düşük sonuçların, düşük oranda gliserol içeren ortama Trehaloz ilavesiyle giderilebileceği sonucuna varıldı.

This study, it was aimed to determine the effects of adding melatonin and liposome to Tris-based extender on post-thaw spermatological parameters in freezing bull semen. For this purpose, ejaculates obtained from three normospermic bulls via artificial vagina were combined to form experimental groups. Different doses of melatonin and liposomes were added to the tris-based extenders containing glycerol 5% (G5) and glycerol 3% + 60 mM trehalose (G3T). The combined ejaculates were divided into 10 equal volumes and diluted with the following diluents: G5, G5+ 0,25 mM melatonin (G5M0.25), G5+ 0,75 mM melatonin (G5M0.75), G5+ 1,25 µl/ml liposome (G5L1,25), G5+3,75 µl/ml liposome (G5L3.75), G3T, G3T+0,25 mM melatonin (G3TM0.25), G3T+0,75 mM melatonin (G3TM0.75), G3T+1,25 µl/ml liposome (G3TL1.25), G3T+3,75 µl/ml liposome (G3TL3,75). The dilution process was carried out at 37o C and the diluted sperm samples were frozen in liquid nitrogen vapor after equilibration into straws and stored in liquid nitrogen. After freezing and thawing, motility in sperm samples was evaluated by looking at the parameters of live-dead ratio (SYBR+), plasma membrane and acrosome integrity (MPAI), mitochondrial oxidative stress (MITOSOX+) and spermatozoon apoptosis rate (Annexin V) in flow cytometry analysis. Post-thaw sperm motility rates in G5, G5M0.25, G5M0.75, G5L1.25, G5L3.75, G3T, G3TM0.25, G3TM0.75, G3TL1.25, G3TL3.75 groups were determined as 61,7±0,01%; 69,20±0,02%; 60,80±0,01%; 65,80±0,02%; 60,00±0,01%; 63,30±0,01%; 66,70±0,02%; 60,80±0,01%; 67,50±0,02%; 59,20±0,01%; respectively. G5M0.25 group provided a higher improvement in post-thaw motility compared to G5 (61,7±0,01%), G5M0.75 (60,80±0,01%), G5L3.75 (60,00±0,01%), G3T (63,30±0,01%), G3TM0.75 (60,80±0,01%), G3TL3.75 (59,20±0,01%) groups (p<0,001). G3TM0.25 and G3TL1.25 groups significantly improved post-thaw motility value compared to the G5 group (p<0,001). In the flow cytometry analysis results, no statistically significant difference was observed between the groups regarding dead-alive ratio, plasma membrane and acrosome integrity, mitochondrial oxidative stress level and apoptosis rates (p>0,05). It was concluded that melatonin added to a Tris-based extender during freezing of bull semen improved post-thaw spermatological parameters. It was determined that melatonin added to G3T and G5 extenders at 0,25 mM and 0,75 mM doses gave similar results in both extenders. As a result, it was observed that antioxidant addition to the G3T extender containing low glycerol protected and improved post-thaw spermatological parameters as much as the G5 extender; it could be used instead of the G5 extender (p<0,001). It was concluded that the toxic effect of glycerol on fertility and especially the low results in spermatological parameters that may arise from the use of low glycerol can be eliminated by adding Trehalose to the extender containing low glycerol.